去整合素Echistatin对糖尿病兔晶状体后囊膜混浊的作用研究

【摘要】糖尿病性白内障是糖尿病第二位常见眼部并发症，手术是其唯一有效治疗手段，后发性白内障（即后囊膜混浊(posteriorcapsularopacification,PCO)）是白内障摘除术后最常见并发症，不仅导致术后视力下降，还对糖尿病眼后段病变的诊断和治疗效果造成较大影响。晶状体上皮细胞增殖和上皮-间质转分化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）在PCO的发生和发展中起重要作用，而细胞间及细胞与细胞外基质间粘附是其生存和增殖的基础。细胞粘附分子-整合素参与调控细胞粘附、迁移、增殖及分化等众多生理过程，对阻断整合素的调控作用是否可以有效抑制糖尿病性PCO发生和发展的研究目前甚少。前期实验已证实去整合素Echistatin(Ecs)可明显抑制体外培养的人晶状体上皮细胞(LensePitheliumcells,LECs)的增殖、粘附及移行；并发现糖尿病兔晶状体囊外摘除术后（extrocapsularlensextration，ECLE）出现PCO的最早时间（10天）和最显著时间（6周）均较正常血糖兔（14天，12周）提前，同期后囊膜混浊程度较正常血糖兔提高。因此为探索去整合素能否有效抑制糖尿病性PCO的发生发展，本实验拟利用糖尿病兔眼晶状体后囊膜混浊模型,观察去整合素Ecs对糖尿病性PCO分级的影响，及体内LECs增殖、细胞粘附和上皮-间质转分化（EMT）的变化；同时检测血清和房水中糖尿病并发症相关因子，即AGEs及IGF-1的含量变化，探讨Ecs是否通过对糖尿病并发症致病因子的调控从而影响PCO的发生发展；并进一步探讨Ecs对细胞内信号传导通路中的关键信号因子PI3K及其下游信号因子ILK基因表达的干预作用，初步明确Ecs在LECs中作用的分子途径，为去整合素Ecs防治糖尿病性后发性白内障提供有力的理论依据。第一部分Ecs对糖尿病兔PCO分级，LECs增殖、细胞间连接及EMT的影响目的：LECs在晶状体后囊膜上的增殖和上皮细胞-间质转化（EMT）是形成PCO的重要环节。细胞粘附则是LECs生存及出现其他生物学行为的基础，细胞间连接蛋白的表达可以在一定程度上反映细胞粘附的情况。亦是PCO形成的重要环节。整合素不仅介导了细胞的粘附，还在细胞增殖、EMT中发挥了重要作用，本实验拟通过观察整合素的阻滞剂-去整合素echistatin对糖尿病兔PCO形成，LECs增殖、粘附及间质转化的影响，了解去整合素是否能有效抑制糖尿病兔PCO的发生发展，并尝试阐述其分子机制。方法：应用四氧嘧啶建立糖尿病兔模型，每只兔右眼均行晶状体囊外摘除术（extrocapsularlensextration，ECLE），术毕随机分组，对照组在术眼晶状体囊袋内注入0.2ml高压蒸馏水，Ecs组则注入0.2ml10μg/mlEcs。分别在术后10天（10d）及6周（6w）观察以下指标：⑴裂隙灯下观察术眼晶状体后囊膜混浊情况并分级；⑵应用免疫组化法检测Ecs对LECs中PCNA表达的影响。⑶应用免疫荧光法检测Ecs对晶状体后囊膜上LECs中连接蛋白43表达的影响；⑷应用免疫组化法和荧光定量PCR(Real-TimeQuantitativePCR,RT-PCR)法检测Ecs对晶状体后囊膜上α-SMA和Ⅳ型胶原表达的影响。结果：⑴术后10天对照组和Ecs组间PCO分级无明显差异(P=0.495)，术后6周Ecs可明显降低糖尿病兔PCO分级(P=0.025)。⑵术后10天及6周Ecs组LECs中PCNA的表达明显低于对照组（p=0.031,0.021）。⑶术后10天及6周对照组晶状体后囊膜上Cx43表达明显增强，而Ecs组仅见少量表达，两组间存在显著差异（p=0.007,<0.001），提示Ecs可有效抑制糖尿病兔模型中LECs间连接蛋白43的表达。⑷术后10天，免疫组化及RT-PCR结果均显示α-SMA在晶状体后囊膜上的表达两组间无明显差异(p>0.05)，术后6周对照组晶状体后囊膜上α-SMA表达显著增多，而Ecs组仅少量增加，表达较对照组明显降低(p<0.05)，提示Ecs可有效抑制术后晚期α-SMA的表达。⑸RT-PCR结果显示晶状体后囊膜上Ⅳ型胶原表达，术后10天两组间无明显差异(p=0.157)，术后6周Ecs组较对照组表达明显增降低(p=0.049)；而免疫组化结果显示无论是10d或6w，Ecs组Ⅳ型胶原表达均较对照组显著减少（p=0.037,0.001）。提示Ecs可有效抑制Ⅳ型胶原的表达，可能部分Ⅳ型胶原mRNA未翻译为蛋白。结论：糖尿病兔PCO模型中，Ecs可有效抑制PCNA、Cx43、α-SMA、Ⅳ型胶原表达，降低PCO的分级，抑制PCO的发生和发展。第二部分Ecs对糖尿病相关因子AGEs、IGF-1及PI3K/ILK信号通路的影响研究目的：晚期糖基化终末产物（advancedglycationendproducts，AGEs）和胰岛素样生长因子-1（insulin-likegrowthactor1，IGF-1）与多种糖尿病并发症的发生均有密切关系，其是否也参与了糖尿病兔PCO的形成？Ecs发挥抑制PCO的作用是否与改变以上两种糖尿病并发症相关因子的表达相关？整合素信号通路中哪些信号因子参与了上述作用的调控？本课题中我们通过一系列实验来探讨以上三个问题的答案，以期进一步了解Ecs抑制PCO发生发展的机制。方法：将兔子分为正常血糖对照组，糖尿病组及Ecs组，所有兔子行ECLE术，分别采集术后10天和6周血清及术眼房水，通过ELISA法检测各标本中AGEs和IGF-1含量的变化。取糖尿病组及Ecs组中兔术眼晶状体后囊膜，通过RT-PCR法检测ILK、PI3K的基因表达变化。结果：ELISA检测结果提示术后10d及6w，糖尿病组及Ecs组血清和房水中AGEs和IGF-1的含量均明显高于对照组（P<0.05）；在糖尿病兔模型中，Ecs组房水中IGF-1含量明显低于糖尿病组（P<0.05），但血清及房水中AGEs含量及血清中IGF-1含量Ecs组与糖尿病组间差异无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR检测结果显示术后10天及6周，与糖尿病组相比，Ecs组晶状体后囊膜上PI3K及ILKmRNA表达下调（P<0.05）。结论：AGEs和IGF-1可能参与了糖尿病兔PCO的发生发展过程，Ecs对糖尿病兔房水中IGF-1的表达有明显抑制作用，可能是其抑制PCO发展的机制之一。Ecs通过下调糖尿病兔晶状体后囊膜上ILK和PI3K的表达，阻碍ILK和PI3K之间信号传导，从而抑制PCO发展。
【作者】陈迎迎；
【导师】谭少健；
【作者基本信息】广西医科大学，耳鼻喉科学，2014，博士
【关键词】糖尿病；后囊膜混浊；去整合素；增殖细胞核抗原；连接蛋白43；α-SMA；Ⅳ型胶原；PCO；Echistatin；AGEs；IGF-1；ILK；PI3K；

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